Microscopie
de fluorescence
Président de Session: Messieurs
J.M.Devoiselle
Visualisation in situ et in vivo
du comportement de liposomes PEG dans les capillaires en situation inflammatoire
au moyen de la vidéo-microscopie de fluorescence intravitale.
Serge MORDON, Jean
Marie DEVOISSELLE, Sylvie BÉGU, Thomas DESMETTRE
(SM, TD) UPRES EA 2689 INSERM IFR22, Pavillon Vancostenobel,
CH&U de Lille,
59037 LILLE cedex mordon@lille.inserm.fr
(JMD, SB) U.F.R. des Sciences Pharmaceutiques, UMR
CNRS/ENSCM 5618 & Laboratoire de Technique Pharmaceutique Industrielle,
Faculté de Pharmacie, 15, av. Charles Flahault, 34060 MONTPELLIER
cedex
Objectifs: Lors
de pathologies inflammatoires, l'intérêt en imagerie et en
thérapeutique de l'utilisation des liposomes repose sur leur capacité
à être capturés par les cellules phagocytantes mononuclées
et les cellules polymorphonuclées (1-3).
Si les images obtenues in vivo en scintigraphie permettent à des
temps tardifs de visualiser une capture des liposomes sur le site inflammatoire,
les événements mettant en jeu la capture des liposomes sur
ces sites sont peu documentés in vivo. Cette étude a donc
pour objectif de visualiser le comportement de liposomes PEGylés
in situ et en temps réel par microscopie de fluorescence intravitale.
Matériels
et méthodes: Le
marqueur fluorescent est la 5,6-carboxyfluorescéine (100 mM) encapsulée
dans des liposomes (DSPC/DPPC/DSPC-PEG, ratio molaire 16:2:1) préparés
par extrusion sur membrane de polycarbonates (100 nm). Ces liposomes sont
injectés chez un hamster porteur d'une chambre optique implantée
(skin flap window, 4). Une
inflammation est induite soit par un geste chirurgical (inflammation chronique)
soit par injection de LPS (5 mg/kg) (inflammation aiguë). Les images
de fluorescence sont obtenues par épifluorescence (microscope Nikon
E800, grossissement x40, x80, excitation: 470 nm FWHM 40nm; émission
540 nm FWHM 40nm) et recueil des images de fluorescence à l'aide
d'une caméra de haute sensibilité (Hamamatsu Photonics C2408).
Un enregistreur vidéo numérique (Sony DV CAM) permet de stocker
les images qui sont étudiées ultérieurement au moyen
d'un ordinateur (logiciel DV MANAGER) .
Résultats: Les
résultats montrent qu'il est possible de visualiser les liposomes
au sein de la circulation sanguine. L'avantage des liposomes PEGylés
repose sur un temps de demi-vie plasmatique élevé. De nombreux
capillaires présentent des thromboses au gré du développement
de l'inflammation. A leur niveau, on visualise clairement l'arrêt
circulatoire concomitant avec une libération très importante
du marqueur hors des liposomes (< 1 min. après arrêt de
la circulation). Par la suite, le recrutement leucocytaire se traduit par
l'apparition de leucocytes adhérents à la paroi vasculaire
: leucocytes roulants et leucocytes adhérants. Ces leucocytes présentent
une fluorescence cellulaire hétérogène et ponctiforme
révélatrice de la capture des liposomes par phagocytose.
Enfin, des cellules marquées sont localisées hors du lit
vasculaire témoignant d'un mécanisme de diapédèse.
Conclusion:
Il est possible d'étudier par cette technique le comportement intravasculaire
des liposomes in situ et en temps réel dans un site inflammatoire
à la résolution microscopique. Ces liposomes sont clairement
identifiables et la microscopiede
fluorescence intravitale montre qu'ils sont capables de libérer
leur contenu dans des zones vasculaires thrombosées. De plus, les
liposomes PEGylées permettent un temps de circulation suffisamment
long et ont la capacité d'être capturés par les leucocytes
activés et de sortir de la vascularisation via un mécanisme
de diapédèse des leucocytes. Des études sont en cours
pour distinguer les types cellulaires mis en cause et localiser la fluorescence
cellulaire.
1-J.F.
Scieszka, M.J. Cho, Pharm. Res., 5,6, 352-358 (1988)
2-M.J.
Cho, J.F. Scieszka, C.T. Cramer et al., Pharm. Res., 6, 1, 78-84 (1989)
3-T.M.
Adams, W.J.G. Oyen, O. Boerman et al., J. Nucl. Med., 39, 2172-2178 (1998)
4-S.
Mordon, T. Desmettre, J.M. Devoisselle et al., Lasers Surg. and Med., 20:
131-141 (1997)
5-J.M.
Devoisselle, S. Mordon, S. Bégu, T. Desmettre Functional
Imaging and Optical Manipulation of Living Cells and Tissues. D.L.
FARKAS (Ed), SPIE, Bellingham, USA, vol 3921 (2000)
UPRES
1947 : Biologie Physico-Chimique des Systèmes Intégrés,
Université de Perpignan, 66860 Perpignan Cedex. Tel: 04 68 66 2115, E-mail: pesco@univ-perp.fr;
vigo@univ-perp.fr; salmon@univ-perp.fr.
La
réponse de líorganisme humain aux agressions chimiques de líenvironnement
peut être étudiée soit au niveau díorganes cibles (poumons,
cheveux, dents) soit par la modification de fonctions sensibles spécifiques
(altérations de la composition de la sueur, des urines) soit enfin
par une analyse des constituants du sang à partir de prélèvements
minimes. Cet ainsi que les lymphocytes circulants paraissaient constituer
un réservoir d'informations intéressantes permettant une
approche quantitative de l'effet des agressions de l'environnement sur
l'homme.
C'est
pourquoi nous nous étions fixé comme objectif:
-
de définir un protocole fiable permettant l'acquisition de paramètres
caractérisant des populations de lymphocytes vivants prélevées
chez des individus,
- d'utiliser ces paramètres
pour, dans une approche multiparamètrique, tester les possibilités
d'une telle approche et une fenêtre de mesure permettant de suivre
des modifications des propriétés de populations de lymphocytes.
Un protocole de triple
marquage Hoescht 33342, Rhodamine123, Rouge Nil, associé à
l'analyse d'images numérisées permetd'obtenir
sur des lymphocytes humains vivants des paramètres morphométriques
(taille des lymphocytes etdes noyaux)et
des paramètres liés à l'état physiologique
des lymphocytes (état énergétique par fluorescence
R123, propriétés de la membrane plasmique par fluorescence
Rouge Nil).
Les
distributions des populations de lymphocytes en fonction de ces paramètres
révèlent, d'un donneur à l'autre, de larges différences
qui nous ont conduità rechercher
l'existence de classes de lymphocytes et à vérifier leur
réalité de leur existence par une analyse factorielle discriminante
sur l'ensemble des lymphocytes des 69 donneurs. Dix classes ont été
définies. Elles ont permis de constituer un groupe d'expérience
qui a été utilisé pour déterminer la compositions
de la population de lymphocytes de chaque donneur. Si 5 de ces classes
sont pratiquement présentes chez tous les donneurs 5 autres apparaissent
comme des événements relativement rares.
La
décomposition des populations de lymphocytes en % de 10 classes
de lymphocytes a permis de montrer que les 69 donneurs se répartissent
en 5 groupes dont un, ne comportant que 4 donneurs, est nettement différencié
des 4 autres. Cette approche a été mise en úuvre pour vérifier
l'absence d'influence du sexe et de l'age sur l'existence de ces 5 groupes
de donneurs. Enfin l'étude de l'effet de l'héparine sur des
populations de lymphocytes de 11 donneurs révèle des perturbations
importantes induites par ce produit (plus fort marquage par R123 et Rouge
Nil). La similitude existant entre la distribution de certainsdonneurs
traités à l'héparine et celle du groupe de 4 donneurs
nettement différencié des 4 autres semble indiquer que ce
groupe pourrait résulter d'atteintes portées aux propriétés
des populations de lymphocytes par un/des facteurs exogènes. La
fenêtre de mesure ainsi déterminée devrait permettre
un élargissement du champ d'application de notre approche.
(1''-Pyrène Butyl)-2-Rhodamine
ester,
un marqueur permettant d'amener le
Pyrène dans les mytochondries .
A-C. Ribou, J. Vigo, J-M. Salmon
Groupe de Microfluorometrie Quantitative, Laboratoire
de Chimie-Physique, Université de Perpignan, 52 Avenue de Villeneuve,
66860, Perpignan.
Tel: 04 68662113; Fax: 04 68662144; email: ribou@univ-perp.fr
Les mitochondries sont d'importantes organelles qui
semblent être la cible d'agents cytotoxiques. La rhodamine 123 (R123)
est un marqueur fluorescent vital spécifique de ces organelles.
Ce marqueur peut être utilisé pour suivre l'activité
mitochondriale de cellules vivantes lors de l'incubation de différentes
drogues (E. Rocchi, thèse). Toutefois, ces expériences ne
donnent aucune information sur les mécanismes responsables des changements
obtenus.
Nous avons démontré que des dérivés
aliphatiques de cette sonde (C9 à C12) marquent les mitochondries
des cellules vivantes tout comme la R123 (V. Jeannot, thèse). Au
vu de tel résultat, on a envisagé d'utiliser la rhodamine
123 pour vectoriser des substances vers les mitochondries.
La concentration en oxygène peut être
mesuré dans les cellules vivantes en utilisant la durée de
vie de fluorescence du pyrène. La quantité d'oxygène
au voisinage des mitochondries pouvant être le facteur limitant de
l'activité mitochondriale, nous avons synthétisé un
dérivé du pyrène en couplant celui-ci à la
R123 par une chaîne de 4 carbones.
Nous présenterons d'abord les propriétés
physico-chimiques de ce composé dans différents solvants.
Dans l'éthanol, on obtient à l'état excité
un équilibre avec une forme repliée non fluorescente, les
durées de vie du pyrène et de la rhodamine en sont diminuées.
Sous azote cet équilibre n'est pas changé et seule la fraction
de pyrène restant sous forme non replié voit son intensité
de fluorescence augmenter. Dans un alcool comportant une longue chaîne
aliphatique (nonanol), au contraire, cette forme non fluorescente n'existe
pas, les durées de vie du pyrène et de la rhodamine en sont
sensiblement augmentées.
Des premiers résultats sur cellules vivantes
ont été obtenus au moyen de techniques de videofluorimétrie
sur des cellules submandibulaires de souris (SCA9). La sonde entre dans
les cellules et cible les mitochondries. La localisation de la sonde est
observée en suivant la fluorescence de la rhodamine avec un analyseur
d'image (SAMBA 2005). Le spectre de la sonde dans les cellules est enregistré
en utilisant un microspectrofluorimètre couplé à un
détecteur CCD multicanal (OMA) de Princeton
Research Instrument.
MicroSpectroFluorimétrie :
Adaptation, caractérisation,
validation et application en cancérologie
M-P Gramain1, J-J Padilla1,
C. Bour-Dill2, A. Dieterlen3, J-L Merlin2,
F. Guillemin1,2
1Laboratoire
d'Instrumentation Médicale Automatisée en Cancérologie
Centre Alexis Vautrin, 54500 Vandúuvre- Les-Nancy
2
Laboratoire
de Recherche en Oncologie, Centre Alexis Vautrin, 54500 Vandúuvre- Les-Nancy
Tél.
: 03 83 59 46 62Fax : 03 83 59 46
62e-mail : mp_gram@club-internet.fr
3Lab.El-Equipe EEA, Université de
Haute-Alsace, IUT, 61 rue A. Camus 68093 Mulhouse
La microscopie de fluorescence
permet de visualiser les sites de fixation des fluorophores au niveau des
organites intracellulaires. L'association des mesures de spectres de fluorescence
et de la microscopie permet d'apporter des informations sur le métabolisme
des cellules tumorales.
L'adaptation d'un spectromètre
sur un microscope optique à épifluorescence a été
réalisée par fibre optique, formant ainsi un poste de microspectrofluorimétrie
(MSF). Il permet le positionnement d'un capteur (caméra ou photomultiplicateur),
la visualisation de la zone de mesure et la mesure spectrale proprement
dite. L'instrumentation a été optimisée puis caractérisée
en déterminant les limites de résolution spatiale, axiale
et spectrale, à partir d'objets fluorescents de taille et de marquage
connus, ainsi que sur des fantômes d'épaisseurs différentes
composés de deux fluorophores (Rhodamine et Iodure de propidium).
La technique a ensuite été
appliquée à des échantillons biologiques. Des modifications
spectrales ont pu être mises en évidence entre deux lignées
sensibles et résistantes d'adénocarcinome mammaire (MCF-7
et MCF-7 DXR) incubées avec une anthracycline (Daunorubicine)
utilisée en chimiothérapie. Les premiers résultats
étant très prometteurs permettent d'envisager des mesures
intracellulaires de photosensibilisants utilisés en thérapie
photodynamique. Par contre, de part les caractéristiques de ces
produits, la technique devra à nouveau passer par une étape
préliminaire d'optimisation.
Mesures
3D en microscopie optique :
Caractérisation
du système et déconvolution des données
S. Razgallah1,
M.-P. Gramain2,
C. Bour-Dill3,
A. Dierterlen1,
C. Xu1, O. Haeberlé1,
D. Dumas4, F.
Guillemin2,
S. Jacquey1
1Lab.El-Equipe
EEA, Université de Haute-Alsace, IUT, 61 rue A. Camus 68093 Mulhouse
Tél. : 03 89 32 42 22Fax
: 03 89 60 45 65e-mail : a.dieterlen@univ-mulhouse.fr
2IMAC,
CRAN, CNRS, UPRES-A 7039, 3LRO,
CAV, 54500 Vandúuvre-Les-Nancy
4Laboratoire
d'AngioHématologie, faculté de médecine, Nancy 1,
Pr Stoltz.
La microscopie 3D de fluorescence est un moyen efficace
díinvestigation volumique de spécimens biologiques. Microscopes
confocal et conventionnel sont les deux principaux types díinstruments
utilisés dans ce domaine. Le microscope confocal possède
une meilleure résolution spatiale mais implique des problèmes
de bruit et de photo-blanchiment (par exemple en thérapie photodynamique
lors d'études de cellules cancéreuses incubées avec
un photosensibilisant). Le microscope conventionnel par coupes optiques
sériées (OSM) utilisant un détecteur CCD à
haute sensibilité donne des images moins bruitées permettant
de diminuer le photo-blanchiment grâce à la faible puissance
díexcitation nécessaire. Par contre, un tel système possède
une moins bonne résolution spatiale, notamment la résolution
axiale à cause des particularités de sa fonction de transfert
optique (OTF). Par conséquent, les mesures géométriques
ou quantitatives sur les données brutes sont entachées d'erreurs.
Une restauration adéquate est indispensable
avant toute mesure 3D. Cette restauration devra améliorer la qualité
des données : corriger les distorsions géométriques
et réassigner les intensités à leurs origines. Une
restauration de qualité nécessite la connaissance du système
d'acquisition et donc de son OTF. Des informations a priori sur le spécimen
étudié peuvent aussi s'avérer utiles.
Quatre méthodes de déconvolution sont
implémentées: inversion directe régularisée
(LLS) maximum a posteriori (MAP), projection dans un espace convexe (POCS)
et maximum de vraisemblance (ML-EM). LLS et MAP sont appréciables
par leurs temps de calcul courts, et peuvent être utilisés
pour des traitements routiniers. En revanche, POCS et ML-EM sont plus coûteux
en temps de calcul. POCS donne de très bons résultats pour
la restauration de spécimens fins, ML-EM est particulièrement
adapté aux images bruitées. Pour mener à bien la restauration,
les paramètres de régularisation que nécessite la
déconvolution sont déterminés par une procédure
automatique en fonction des valeurs propres du système et d'une
estimation de la puissance du bruit. Cette automatisation implique la facilité
d'utilisation et la répétabilité inter-utilisateur.
Nous présentons les méthodes
expérimentales de caractérisation du système. Avec
ces données, nous pouvons identifier líinfluence de différents
paramètres expérimentaux, ce qui permet d'établir
le protocole d'acquisition des échantillons biologiques. Ensuite,
nous présentons la chaîne de traitement et de restauration
de données 3D développée au laboratoire. Les objets
fluorescents sont segmentés puis labellisés après
avoir déconvolué les données brutes. On peut ainsi
déterminer le facteur díélongation axial sur des billes fluorescentes
de référence. Les analyses statistiques, géométriques
ou morphologiques deviennent alors significatives. Nous appliquons cette
méthodologie sur des images de cellules cancéreuses marquées
par une molécule fluorescente utilisée en chimiothérapie
School
of Physics A28, University of Sydney, NSW 2006, Australia.
Tel:
++612 9351 2553Fax: ++612 9351 7727E-mail:
regis@physics.usyd.edu.au
De
nos jours, il existe de nombreuses techniques en microscopie optique qui
sont appliquées à des domaines aussi variés que l'étude
des matériaux et de l'environnement, la biologie, et la biomédecine.
Ces techniques consistent notamment à la microscopie optique conventionnelle,
à interférences (traditionnelles ou à contrastes différenciés),
confocale, et plus récemment multi-photons. L'intérêt
croissant pour les microscopes basés sur des phénomènes
non-linéaires découle de leur capacité à produire
des images tri-dimensionnelles par le biais d'un sectionnement optique
résultant des propriétés spatiales de l'interaction
entre le faisceau laser à pulses qui est focalisé dans l'échantillon
et les propriétés optiques non-linéaires de ce même
échantillon. En outre, la microscopie multi-photons offre l'avantage
(par rapport aux techniques confocales notamment) d'une réduction
des dommages biologiques à l'échantillon et d'un plus grand
pouvoir de pénétration grâce à l'utilisation
d'une longueur d'onde d'illumination plus élevée. Toutes
ces différentes méthodes microscopiques vont évidemment
fournir des informations différentes, voir complémentaires,
quant à l'échantillon. Jusqu'alors néanmoins, ces
methodes ont été utilisées indépendemment ou
au mieux consécutivement. Ici, nous démontrons le potentiel
de l'imagerie à fluorescence excitée par deux-photons (TPF)
et de l'imagerie basée sur la génération de deuxième
harmonique (SHG), opérées à la fois séparemment
et simultanément sur le même volume d'un échantillon.
Cette nouvelle approche, intitulée microscopie multi-photons
à multiples détections simultanées, est caractérisée
en utilisant et modifiant un microscope confocal et un laser femtosecond
Ti:S commerciaux. Le signal fluorescent est enregistré par un détecteur
en réflection et le signal deuxième harmonique par un détecteur
en transmission. L'étude d'échantillons consistant de chromosomes
d'une mouche australienne montre que cette méthode à multiples
détections simultanées permet l'obtention d'informations
chimiques et structurelles non-accessibles par les imageries TPF et SHG
uniquement.