Imagerie tridimensionnelle in vivo de l'úil à très haute résolution spatiale

M. GLANC ^(1,2), H. GARDETTE ⁽¹⁾, E. GENDRON ⁽²⁾, A. DUBOIS ⁽³⁾,

J.F. LEGARGASSON ⁽¹⁾, C. BOCCARA ⁽³⁾, P. LENA ⁽²⁾

(1)Université P7, UFR Lariboisière/Saint-Louis, Laboratoire de biophysique de la vision,

10 av de Verdun 75010 PARIS_

Tel : 01 44 89 78 06 _ Fax : 01 44 89 78 23

marie_glanc@hotmail.com, gardette.hubert@caramail.com,legargas@ext.jussieu.fr

(2)Observatoire de Meudon, DESPA, 5 pl Jules Janssen 92195 MEUDON cedex _

Tel : 01 45 07 75 45 _ Fax : 01 45 07 79 17

(3) Ecole Supérieure de Physique et Chimie Industrielle de Paris, Laboratoire díOptique Physique, 10 rue Vauquelin, 75005 PARIS_

Tel : 01 40 79 46 03 _ Fax : 01 43 36 23 95

dubois@optique.espci.fr,boccara@optique.espci.fr

La mise au point díun instrument permettant líétude haute-résolution in vivo de la rétine en surface et en profondeur, ouvre des perspectives díavenir dans les domaines de líophtalmologie thérapeutique et de la recherche biomédicale. Le concept de cet instrument est basé sur une technique díimagerie astronomique - líOptique Adaptative - pour le balayage (x,y), et sur líOCT pour líimagerie en z. On espère ainsi atteindre une résolution de líordre du micron en (x,y) et de quelques microns en z.

La société CILAS participe également au projet par le prêt de matériel optique et líapport de compétences dans le domaine informatique.

E. Guiot¹, P. Georges¹, A. Brun¹, F. Mérola², B. Arrio³, S.Marze³ et M.P. Fontaine-Aupart³

Unité mixte de recherche associée au Centre National de laRecherche Scientifique,

UMR 8501,B.P. 147, 91403 Orsay.

Tel : (33) 1 69 35 88 45, FAX : (33) 1 69 35 88 07.elvire.guiot@iota.u-psud.fr

2-Laboratoire pour líUtilisation duRayonnement Electromagnétique, 91898 Orsay Cedex.

3- Laboratoire de Photophysique Moléculaire, UPR 3361, 91405Orsay Cedex.

La corrélation de fluorescence est basée sur líanalyse desfluctuations temporelles de líintensité de fluorescenceémergeant díun très petit volume contenant peu de molécules fluorescentes. Cetteméthode permet díétudier certains paramètres tels que lesconstantes de diffusion des molécules, leur concentration, leurpropriétés photophysiques, selon leur environnement, informations quíil serait difficile voireimpossible díobtenir par les méthodes de microscopieconventionnelles. Le problème du confinement de líexcitation enun volume extrêmement petit a été résolu par líutilisation de la microscopie confocale et plusrécemment, grâce au développement des sources laser femtoseconde,par líexcitation biphotonique. Cette dernière technique offreplusieurs avantages : líabsorption biphotonique nía lieu que lorque líénergie delíexcitation est confinée à la fois spatialement ettemporellement. Le volume díexcitation est donc défini par lepoint de focalisation et líéventuel risque de dégradation de líéchantillon est limitéà ce volume. Par ailleurs, líutilisation de longueurs díonde dans líinfrarouge permet une meilleure profondeur depénétration dans les échantillons biologiques. Líassociation de líexcitationbiphotonique et de la corrélation de fluorescence présente donc ungrand intérêt dans líétude des milieux biologiques [1].

Nous avons développé un montage expérimental pourlíétude de corrélation de fluorescence par excitationbiphotonique. Cette méthode a permis la détermination des constantesde diffusion (D) de plusieurs sondes díintérêt biologique : FITC-Dextran de différentes massesmoléculaires, GFP (Green Fluorescent Protein) et fluoresceine. La grande sensibilité du système a permis díaccéderà la détection de la fluorescence díune molécule unique de fluoresceineen milieu acqueux. Pour chacun des troisfluorophores étudiés, nous avons vérifié la variationlinéaire de D en fonction de la viscosité du milieu, résultat en accord avec la théorie. Ces résultatsforment la base des études de ces sondes en milieu cellulaire portantsur líanalyse de líhétérogénéitéintracellulaire via la variation des constantes de diffusion.

[1] K.M.Berland, P.T.C. So and E. Gratton, Biophysical Journal 68, 694-701 (1995).

Guy TESTYLIER, Laura TONDULI

Centre de Recherches du Service de Santé des Armées

Laboratoire de Neuropharmacologie

24 av. des Maquis du Grésivaudan

BP 87 - 38702 LA TRONCHE Cedex

Le système cholinergique est impliqué dans plusieurs fonctions cérébrales essentielles. Il joue un rôle clef sur la vigilance et la mémorisation. Son altération provoque une dégénérescence du système nerveux et une perte des fonctions cognitives comme on l'observe dans la maladie d'Alzheimer.

L'acétylcholinestérase (AChE) est abondante dans le système nerveux central et constitue le principal facteur de contrôle de l 'activité cholinergique. Cette enzyme est de plus la cible privilégiée des traitements actuels contre la maladie d 'Alzheimer ainsi celle des neurotoxiques organophosphorés.

Nous avons développé dans ce travail, une nouvelle méthode de dosage " in vivo "de l'AChE utilisant les techniques de microdialyse couplées à une détection optique en ligne de l 'activité de l 'enzyme. La méthode consiste à perfuser la membrane de microdialyse avec une solution de Ringer contenant de l'acétylthiocholine qui sert de substrat à l'AChE et de recapter dans le dialysat la thiocholine produite par l'enzyme. Cette thiocholine mélangée à du DTNB produit la réaction colorimétrique d 'Ellman que l 'on suit grâce à une cellule optique placée en ligne à la sortie de la membrane de dialyse.

Nous avons évaluer la validé de cette méthode en mesurant l'activité AchE au cours d'une intoxication avec un organophosphoré, le VX. Les inhibitions observées ont été comparées à celles mesurées "ex vivo" en fin d'expérience.