Soutenance de thèse de Sun Pulu

Etude de gènes impliqués dans la biosynthèse du parfum chez la rose, Rosa x hybrida

Molecular and biochemical studies of fragrance biosynthesis in rose

Summary in French:
La rose est l'une des plantes ornementales les plus populaires, dont les composés volatils sont non seulement impliqués dans les interactions des fleurs avec l’environnement au sens large, mais aussi largement utilisés dans l’industrie des arômes et parfums. Le chapitre 1 décrit l'histoire de la culture de la rose, les usages de son parfum, les connaissances actuelles sur la biosynthèse des composés de ce parfum, ainsi que les voies de biosynthèse des composés volatils qui ont été récemment élucidées chez différentes plantes. Les chapitres expérimentaux 2 et 3 analysent les fonctions de deux gènes exprimés dans les pétales de rose. Ils codent pour des protéines Nudix hydrolase 1 (NUDX1). Le gène NUDX1-1 (nommé RhNUDX1 dans la publication) a été découvert en comparant les transcriptomes de deux cultivars de rose, Rosa x hybrida cv. 'Papa Meilland' (PM) très parfumé et R. x hybrida cv.
'Rouge Meilland' (RM), dépourvu de parfum. Le gène RhNUDX1-1 n'est exprimé que chez PM et son expression est corrélée avec la production de monoterpènes dans les pétales, en particulier de géraniol. Lors de l'étude d'une descendance issue du croisement de R. chinensis cv. ‘Old Blush’ (OB) et de R. x wichurana (Rw), le gène orthologue RcNUDX1-1a, présentant la même fonction, a été caractérisé chez OB. Un gène paralogue, RwNUDX1-2, a été découvert chez Rw et il a été démontré que son expression présentait une corrélation avec la production sesquiterpènes, en particulier de E,E-farnesol. Une série d'analyses in vitro et in vivo ainsi qu'une analyse de corrélation ont permis de vérifier la fonction de RhNUDX1-1, qui hydrolyse le géranyl diphosphate (GPP) en géranyl
monophosphate (GP). Une phosphatase non identifiée pourrait catalyser la transformation du GP en géraniol. Des expériences de fusion avec la Green Fluorescent Protein (GFP), suivies de transformation transitoire de feuilles de tabac, ont révélé que RhNUDX1-1 était localisée dans le cytoplasme. Les mêmes approches (analyses QTL, essais enzymatiques et expression transitoire) ont également été appliquées à RwNUDX1-2, démontrant sa fonction dans la production de E,E-farnesol. La cartographie de RwNUDX1-2 et la localisation subcellulaire de la protéine sont encore à l’étude. De plus, la cristallographie des protéines et la modélisation ont été employées pour étudier le mécanisme de l'interaction NUDX1-substrat et les acides aminés potentiellement importants pour la reconnaissance du substrat. Collectivement, ces données révèlent une voie alternative pour la biosynthèse des terpènes, en particulier le géraniol et E,E-farnesol, via l'hydrolyse des prényl diphosphates par les enzymes NUDX1.

Nos résultats montrent que la production de composés volatils dans les pétales est fortement corrélée avec l’expression des gènes des voies de biosynthèse. Par conséquent, la régulation transcriptionnelle de RcNUDX1-1a et RwNUDX1-2 joue probablement un rôle important dans la production de parfum. Les promoteurs de RcNUDX1-1a, RcNUDX1-1b, et RwNUDX1-2 et deux facteurs de transcription (FT), RcbHLH79 (OB TF) et RwbHLH79 (Rw TF) ont ainsi été isolés et testés (Chapitre 4). Les FT candidats ont été choisis lors d’une analyse RNA-Seq (Chapitre 5). En utilisant des tests d'expression transitoire avec le gène rapporteur GUS (β-glucuronidase) dans les pétales de rose, il a été montré que les trois promoteurs pouvaient entraîner l'expression de GUS. Les deux FT ont ensuite été introduits dans des feuilles de tabac avec les promoteurs testés, pour voir s’ils étaient capables d'activer ces promoteurs. Aucune transactivation significative n'a été détectée, même si Rw TF semblait pouvoir activer une construction témoin (promoteur du gène de la tomate TPS5). L'expression de ces deux FT dans la descendance a également été analysée mais, en raison de
la similarité des séquences, aucune amorce spécifique n'a pu être obtenue. Les transcriptomes de quatre cultivars de rose, dont deux produisent du géraniol mais pas de E,E-farnesol et deux autres produisent du E,E-farnesol mais pas de géraniol, ont été analysés (Chapitre 5) et ont abouti à une liste de FT putatifs pour une étude plus approfondie.

Summary in English:

Roses are one of the most popular ornamental plants, whose volatiles are not only involved in environmental interactions but also widely used for industries. Chapter 1 describes the cultivation history of roses, usages of rose fragrance, knowledge on the biosynthesis of rose scent compounds, as well as non-canonical biosynthesis pathways of other plant volatiles. Experimental chapters (Chapter 2 and 3) analyse the functions of two genes expressed in rose petals, both encoding Nudix hydrolase 1 (NUDX1) protein. NUDX1-1 gene (named RhNUDX1 in the publication) was first discovered by comparing the transcriptomes of two rose cultivars, the scented Rosa x hybrida cv.‘Papa Meilland’ (PM) and the unscented R. x hybrida cv. ‘Rouge Meilland’ (RM). RhNUDX1-1 was only expressed in scented PM and its expression exhibited a positive correlation with the monoterpenoid production in petals, especially geraniol. When studying a rose progeny of R. chinensis cv. ‘Old Blush’ (OB) and R. x wichurana (Rw), an orthologous gene RcNUDX1-1a was found in OB, whose expression also had positive correlation with geraniol emission. A paralogous gene in Rw, RwNUDX1-2, was discovered and it was shown that its expression displayed a correlation with the sesquiterpenoid production, especially E,E-farnesol. A series of in vitro and in vivo assays as well as correlation analyses verified the function of RhNUDX1-1, which hydrolysed geranyl diphosphate (GPP) to geranyl monophosphate (GP). The transformation of GP into geraniol is supposed to be processed by an, as yet, unidentified phosphatase. The prediction of the localisation together with green fluorescent protein (GFP) fusion experiments revealed that RhNUDX1-1 was located in the cytosol. A series of approaches (QTL analyses, enzymatic assays and transient expression studies) were also applied to RwNUDX1-2, demonstrating its function in the production of E,E-farnesol. Mapping of RwNUDX1-2 and subcellular localization of the protein are still under investigation. Furthermore, protein crystallography and protein modelling illustrated the NUDX1-substrate interaction and proposed several residues that may be important for substrate recognition, although further experimental and computational data are required to gain more insight into the enzymatic mechanism. Collectively, these data revealed an alternative pathway for the biosynthesis of terpenoids, especially geraniol and E,E-farnesol, in rose, via the hydrolysis of prenyl diphosphate by NUDX1 enzymes.

Transcriptional regulation of RcNUDX1-1a or RwNUDX1-2 probably plays an important role in the scent production by rose petals. Therefore, three promoters, pOB1a (promoter of RcNUDX1-1a), pOB1b (promoter of RcNUDX1-1b, not expressed in rose petals), pRw (promoter of RwNUDX1-2) were cloned and tested (Chapter 4). In addition, two transcription factors (TFs), RcbHLH79 (OB TF) and RwbHLH79 (Rw TF) candidates were chosen via RNA-Seq analysis as their expression correlated with expression of RcNUDX1-1a or RwNUDX1-2, respectively (Chapter 5). Using transient expression assays with a reporter gene, β-glucuronidase (GUS) in rose petals, it was shown that all three promoters could drive the expression of GUS, suggesting that all of them are active. However, quantification of promoter activities is still needed. OB TF and Rw TF were introduced into Nicotiana benthamiana leaves together with the promoters driving GUS , to determine if they were able to activate these promoters. However, no significant transactivation was detected in any promoter-TF combination. The expression of the TF in the progeny was also analysed but, due to the similarity of the sequences of family members, no conclusive data were obtained. Transcriptomes of the petals four roses, two of which produce geraniol but not E,E-farnesol and two that produce E,E-farnesol but not geraniol, were analysed (Chapter 5) and this resulted in a list of putative scent-related genes and transcription factors for further study.